在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括:制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接,制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体(vecors)在细胞内自我复制,并带动重组的分子片段共同增殖,从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆,就可以深入分析基因的结构与功能,随着引入的DNA片段不同,有两种DNA库,一种是基因组文库(genomic library),另一种是cDNA库。

载体  所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA,分子大小为1-20kb,对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。

噬菌体(phaeg) 噬菌体是感染细菌的病毒,按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA,基因组约为50kb,最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。

黏性质粒(cosmid) 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。

表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。

基因库的建造

含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体,其含有感光趣的基因片段的重组子,可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来,所得到的克隆经过纯化和扩增,可用于进 一步的研。其主步骤包括:(1)构建基因库迅速的载体;(2)DNA片段的制备;(3)DNA片段与载体DNA的连接;(4)包装和接种。

cDNA库的建造

是指克隆的DNA片段,是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库,不含内含子。

特异基因的筛选

常用的方法有:(1)克隆筛选即探针筛选法;(2)抗体检测法,检测其分泌蛋白质来筛选目的基因;(3)放射免疫筛选法,查出分泌特异抗原的基因;(4)免疫沉淀法,进行特异基因的筛选。

核酸序列测定

DNA的碱基序列决定着基因的特性,DNA序列分析 (测序,sequencing)是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因,最终均需进行核酸序列分析,可藉以了解基因的精细结构,获得其限制性内切酶图谱,分析基因的突变及对功能的影响,帮助人工俣成基因、设计引物,以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等,近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素,然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解,在电泳和自显影后,可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂,如:2`,3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长,与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应,这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段,经凝胶电泳分离和放射自显影,可读出合成的DNA核苷酸序列,根据碱基互补原则,可推算出模板DNA分子的序列。

化学降解法只需一化学试剂,重复性好,容易掌握;而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶,便随着M13噬菌体载体的发明和运用,合成的引物容易获得,测序技术不断改进,故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪,使测工作更快速和简便,而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序,然后反推RNA序列。