(1)诊断技术分类

1)根据目的基因是否被放大分类 可分为杂交法和扩增法。前者被检测的目的基因不被放大,如分支链DNA技术,但用杂交法可以进一步检测经过放大了的基因片段,如PCR产物杂交分析;后者包括PCR及连接酶链反应,Qβ复制酶系统等。

2)根据被测基因的核酸类型分类 ①在杂交法中,Southern印迹用于检测DNA;Northern印迹用于检测RNA;斑点印迹或称斑点杂交,既可检测DNA也可检测RNA。②PCR法主要用来直接扩增DNA,但是通过逆转录技术,可以将RNA先转变为cDNA再行扩增,称逆转录PCR,如检测HCV、HGV、HIV等。③原位杂交,或原位PCR,也可分DNA或RNA原位杂交和原位PCR或原位逆转录PCR。

3)根据是否提高了敏感度分类 分支链DNA技术(bDNA),就是根据固相杂交的原理,采用了一种放大标记探针,目的探针不被放大,但检测信号被放大,从而提高了敏感度;套式或巢式PCR,是用两套引物(内、外引物)作两轮PCR,第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作为模板,敏感度进一步提高,常用于极微量病毒基因检测,如检测TT病毒,以及检测大多数RNA病毒(称逆转录套式PCR)。

4)根据待测标本的性质 分体液(血、尿、粪、痰液、胸腹水等等)、细胞和组织基因检测。①体液中的待测基因可在将标本适当处理后,根据需要采用上述各种方法检测;②组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法;③细胞内病原体基因检测可以通过细胞裂解,释放了待测基因后,采用与体液检测相同的方法,也可将细胞固定于一定载体上,如玻片,或硝酸纤维膜上(如平板上细菌菌落内的基因鉴定),采用类似于组织基因测定的方法。

5)根据诊断目的或要求 分为定性诊断、定量诊断和半定量诊断,以及序列分析等。

(2)基因诊断的策略

1从基因产物入手 这是一种比较早期的诊断策略。首先分析异常基因的产物(蛋白质),并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质以后,进行氨基酸序列测定,据此合成寡核苷酸探针,从互补DNA(cDNA)文库或基因组文库中筛选克隆,然后通过DNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA,由表型至基因型。迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病、苯丙酮尿症(PKU)和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离的。

2从基因定位入手 根据遗传连锁图将致病基因定位在染色体的某一具体位置上,这种基因定位和克隆的策略称为定位克隆。比较正常和异常基因的差别,就可找出导致遗传病的分子缺陷,进而阐明正常和异常基因产物(蛋白质)的生理功能和病理效应。常用于染色体上基因定位的遗传标记有限制片段长度多态性(RFLP)、可变数目串联重复序列(VTR)、短串联重复序列(STR)及近年来发展起来的单核苷酸多态性(SNPs)等。

3从比较正常和异常基因的差异入手 临床上较常见的一些遗传病如糖尿病、重度肥胖、哮喘、精神病等都是由多个疾病基因与有害环境因素相互作用的结果。比如,已定位的2型糖尿病易感基因有10多个,其中单个基因的作用是微小的,但存在累加效应。对于这些复杂遗传病,目前主要采用表型克隆方法进行诊断。表型克隆是将表型与基因结构或基因表达的特性结合起来,直接分离该表型的相关基因。这种策略既不用事先知道基因的生化功能或图谱定位,也不受基因数及其相互作用方式的影响。

(3)方法和原理

1.杂交法

1)原理

杂交技术的基本原理是相同的。病原体基因的一级结构中都含有四种碱基:DNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T),RNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。在双链DNA或RNA中这四种碱基以固定关系配对,即A-T(或A-U),C-G,这种碱基配对关系就构成了DNA或RNA两条链的互补关系,也就是说,两条链之间是严格地通过A对T(或A对U)、C对G的关系结合在一定的。在一定的温度下,这两条链可以打开,变成分离的两条链,但又可以在一定温度下结合起来,这种”再结合”仍然遵循互补原理,但是再结合时的两条互补链是随机碰撞而形成双链的,也就是说再结合后的两条链已经不再是”元配”的了,”杂交”一词就由此而来。如果我们在一条链上”打上标记”,并用它去与另一条链杂交,如果另一条链的确存在,就必然会发生杂交反应,杂交体(新的双链)上也就会被同样带上了标记,再用特定的技术可以探测到标记信号。

2)方法

杂交法中最关键的技术是制备标记探针。标记探针的制备过程包括探针的制备和探针的标记两部分,可分别亦可同步进行。常用的方法有切口平移法、随机引物法、末端标坊法、单链探针制备和标记等。目的还有应用比较广泛的寡核苷酸标记探针,即在寡核苷酸化学合成过程中将标记物(放射性的或非放射性的)掺入或修饰在探针上。

(1)斑点杂交:将待测标本用点状加样法,直接滴加膜上,然后用碱溶液使核酸变性并结合在膜上,再经中和及烘烤(尼龙膜可用紫外线照射)后,与探针进行杂交。

(2)Southern印迹:又称凝胶电泳印迹转移杂交。是电泳技术与杂交技术结合的一种方法。先将待测标本病原体DNA分离,经限制性内切酶消化成一系列片段,进行琼脂糖凝胶电泳,各片段因分子量不同而彼此分开,然后经碱处理凝胶,使DNA的变性,在原位将单链核酸吸印到硝酯纤维膜上,经烘干、固定,以放射性核素标记DNA探针进行杂交,最生洗膜和放射自显影,从显影区带鉴定待测标本DNA。

(3)Northern印迹:是指RNA(主要mRNA)的分子杂交技术。其原理和操作过程基本上与Southern印迹法相同。差别在于电泳标本是RNA,使用的探针是标记的DNA。

(4)原位杂交:是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种特殊技术。用标记核酸探针,与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构,然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测特定的核酸分子所在的部位。由于本法不需从细胞中提取核酸并可直接观察待测核酸所在的细胞类型、细胞内分布状态与细胞染色体的关系,因此常是检测病毒与细胞关系的极好方法。