在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下,基因的制备方法主要可分为两大类:一类是基因化学合成法,一类是基因生物制备法。一般又可将基因生物制备法分为文库法、cDNA 文库法和PCR法等。

1 化学合成法。

就化学本质而言,基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子结构,就可以进行基因的化学合成。有关DNA 的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及固相亚磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法,而固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA 自动合成仪所使用的方法。由于现代科学技术的发展,DNA 的化学合成已经广泛采用DNA 自动合成仪进行,因此现在仅在少数特殊情况下,采用人工合成。

目前,化学合成基因的思路主要有两条:① 全基因合成,一般适于分子较小而不易获得的基因。首先根据双链基因序列,合成长度为40~60个碱基的寡核苷酸单链片段,并使每对相邻互补的片段之间有4~6个碱基交叉重叠,然后将除基因两个末端外的所有片段磷酸化,在混合复性后加入DNA 连接酶,即可获得较大的基因片段。如果需连接的DNA 片段较多,可采用分步连接及克隆 的方法,最后将的较大片段重组为完整的基因。② 基因的半合成,一般适于分子较大的基因。首先合成末端间有10~14个互补碱基的寡核苷酸单链片段,复性后以重叠区为引物,利用DNA 聚合酶I大片段或逆转录酶等催化合成反应,即可获得两条完整的互补双键DNA 。

基因的化学合成法主要用于PCR扩增引物、核酸测序引物、核酸杂交探针和合成接头等富核苷酸片段的合成。

2 文库法。

基因组文库法是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。所谓基因组文库(gene library或gene bank),是指汇集某一基因组所有DNA 序列的重组DNA 群体。高等真核生物染色体基因组文库通常是以λ噬菌体作为载体构建的,有时也可以柯斯质粒作为载体构建。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下:① 选用识别序列均为4个核苷酸的两种限制性内切核酸酶,对从某一高等真核生物组织细胞中提取的染色体基因组DNA 进行部分酶解,得到10~30 kb的 DNA 限制性片段,利用凝胶电泳法等从中分离出大小为 20 kb左右的随机片段群体。② 选用适当的限制性内切核酸酶酶解λ噬菌体载体DNA 。③ 经适当处理,将基因组DNA 限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌,形成大量噬菌斑,从而形成含有整个DNA 的重组DNA 群体,即文库。

具备了文库,就可以适当的目的基因片段作探针,利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术,从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落,再经过扩增提取其中的重组体,最后即可获得所需要的目的基因片段。

3 cDNA 文库法。

虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因,但是由于高等真核生物基因组DNA 文库比其cDNA 文库大得多,相关工作量同样大得多。更为重要的是,在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子,但在大肠杆菌等原核生物中尚未发现类似序列的存在,大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列,即不能表达真核生物DNA 。而在真核生物成熟mRNA 中已不存在间隔序列(已在拼接过程中被去除),以真核生物成熟mRNA 为模板,逆转录而成的cDNA 可被大肠杆菌表达。因此,在基因工程中,cDNA 文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。

所谓cDNA 文库,是指汇集以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而成的cDNA 序列的重组DNA 群体。

cDNA 文库通常以λ噬菌体和质粒作为载体构建。构建cDNA 文库的一般操作程序如下:(1)总RNA 的提取。从细胞中提取RNA 与提取DNA 的方法基本相同。但是,由于RNA 因不易失活,因此在分离RNA 时,抑制RNA 酶的活性特别重要。常用的RNA 酶的抑制剂有异流氰酸胍、盐酸胍、二乙基焦碳酸(DEPC)等。(2)mRNA 的分离。真核细胞mRNA 一般为其总RNA 的1%~5%,每种特异mRNA 的量非常少。因此,要提取特异mRNA ,就需要选择特异而高度分化的组织。在这些组织细胞中特异mRNA 所占的比例较大。真核细胞mRNA 的3端一般带有poly(A)序列,这一重要特性常被用于从总RNA 中分离带poly(A)的mRNA 。(3)cDNA 双链的合成。以poly(A)RNA 为模板,以olgo(dT)作引物,加人4种三磷酸脱氧核苷(dNTP),在逆转录酶的作用下,合成cDNA 第一链,在链的末端弯回形成一发夹结构;碱处理降解RNA 与DNA 杂交双链中的RNA 模板键;以cDNA 第一链为模板,发夹结构为引物,在逆转录酶或DNA 聚合酶I(或其Klenow片段)作用下,利用4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)合成cDNA 第二链;用特异切除单链的S1酶切去发夹环部分,最终得到平端双链cDNA 。需要指出的是,逆转录能否形成全长cDNA ,取决于转录中所取的条件、模板的结构和纯度。为了获得全长cDNA ,并提高其在总cDNA 中的比例。需要注意:提高底物dNTP的浓度,或加入一定量的焦磷酸钠等;加入氢氧化甲基汞或解链蛋白,以打开mRNA 的二级结构,使逆转录酶易于穿越mRNA 的特异性区域;加入RNase抑制剂,以防止污染的RNase对模板的降解作用;在合成cDNA 第二链时,采用无5¹→3¹外切核酸酶活性的大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段,而不是全酶。(4)cDNA 与载体的连接。 (5)噬菌体的包装及转染或质粒的转化,形成大量噬菌班或菌落,从而形成以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而成的cDNA 序列的重组DNA 群体即cDNA 文库。

同样,具备了cDNA 文库,就可以适当的目的基因片段作探针,利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术,从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落,再经过扩增,提取其中的重组体。最后即可获得所需要的目的基因片段。

目前采用cDNA 克隆 技术已经分离了许多与园艺产品采后生理相关的基因,如在番茄cDNA 文库中建立了146个与成熟相关的,得到了与果实硬度有关的PG基因,与乙烯生物合成有关的ACC合成酶基因、ACC氧化酶基因等。

4 PCR扩增法。

当已知目的基因的序列时,通常利用PCR(Polymerase Chain Reaction,即多聚酶链式反应)技术来分离目的基因。PCR技术是1985年由美国Cetus公司开发的专利技术,它能快速、简便地体外扩增特定的DNA 片段,具有高度的专一性和灵敏度。而一些改进的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特异扩增。在此,不再赘述。